Как работает редактирование генома?
Редактирование генома - это процесс, в котором генетический код организма изменяется. Ученые используют ферменты, чтобы «разрезать» ДНК, создавая двухцепочечный разрыв (DSB). Восстановление DSB происходит путем негомологичного присоединения конца (NHEJ) или гомологичного восстановления (HDR). NHEJ производит случайные мутации (нокаут гена), в то время как HDR использует дополнительную ДНК для создания желаемой последовательности в геноме (нокдаун гена).

4 метода редактирования генов: инструменты для изменения генома
Редактирование генов может показаться простым на бумаге, но это далеко не так. История генной инженерии насчитывает почти 70 лет с момента открытия двойной спирали. С тех пор ученые потратили десятилетия, пытаясь раскрыть способы редактирования генома, которые уравновешивали специфичность со временем и затратами.
1. Ферменты рестрикции: оригинальный редактор генома
Возможность редактирования генов стала реальностью благодаря открытию ферментов рестрикции в 1970-х годах. Рестрикционные ферменты распознают специфические паттерны нуклеотидных последовательностей и разрезаются в этом месте, предоставляя возможность вставить новый материал ДНК в этом месте.

В настоящее время рестрикционные энзимы обычно не используются для редактирования генов, поскольку они ограничены признаками нуклеотидов, которые они распознают, но сегодня они широко используются для молекулярного клонирования. Кроме того, определенные классы рестрикционных ферментов играют ключевые роли в картировании ДНК, картировании эпигенома и конструировании библиотек ДНК.

2. Цинковые нуклеазы (ZFN): повышенный потенциал распознавания
Со временем потребность в точности в редактировании генома стала более очевидной. Ученым нужна была техника редактирования генов, которая распознавала сайт, который они хотели редактировать, так как нецелевые эффекты могли быть вредными. Открытие в 1980-х годах нуклеаз цинкового пальца (ZFN) решило эту проблему.

ZFN состоят из двух частей: сконструированной нуклеазы (Fokl), слитой с ДНК-связывающими доменами цинкового пальца. ДНК-связывающий домен цинкового пальца распознает сайт ДНК с 3 основаниями и может быть объединен для распознавания более длинных последовательностей. Кроме того, ZFNs действуют как димеры, увеличивая длину сайта узнавания ДНК и, следовательно, увеличивая специфичность. Однако, хотя специфичность увеличилась с ZFN, она не была идеальной.
Одним из основных препятствий с использованием ZFN было то, что требование в отношении 3-х базовых пар усложняло конструкцию. Целевые сайты, богатые гуанином, оказались более эффективными при редактировании, чем сайты, не богатые гуанином. Кроме того, поскольку взаимодействие ZFN с ДНК является модульным (то есть каждый ZF взаимодействует с ДНК независимо), эффективность редактирования также была поставлена под угрозу. Поэтому ученым необходимо было решить эти проблемы, если они хотят более эффективно редактировать геном.

ZFNs показали реальные перспективы в области медицины. Примечательно, что ученые использовали ZFN для отключения CCR5 на Т-клетках человека, главном рецепторе ВИЧ. После ZFN-опосредованного редактирования ученые обнаружили, что аутологичные CD4 + Т-клетки безопасны в использовании и представляют собой захватывающий потенциал для терапии ВИЧ. Кроме того, ZFN были использованы для редактирования инфильтрирующих опухоль лимфоцитов в качестве стратегии лечения метастатической меланомы.
3. TALENs Редактирование генов: разрешение одного нуклеотида
В 2011 году появилась новая методика редактирования генов, которая стала улучшением по сравнению с ZFN. Активирующие транскрипцию подобные эффекторные нуклеазы (TALEN) структурно сходны с ZFN. Оба метода используют нуклеазу Fokl для разрезания ДНК и требуют димеризации для функционирования, однако ДНК-связывающие домены различаются. В TALEN используются эффекторы, подобные активаторам транскрипции (TALE), тандемные массивы из 33-35 аминокислотных повторов. Аминокислотные повторы обладают распознаванием единичных нуклеотидов, тем самым увеличивая направленность и специфичность по сравнению с ZFN.

Даже с разрешением в один нуклеотид использование TALEN в качестве инструмента редактирования генов все еще требовало больших затрат времени и средств и имело определенные конструктивные ограничения. Структура TALEN означала, что целевому сайту требовались 5'-тимин и 3'-аденин, что ограничивало настраиваемость цели. Кроме того, TALENs показали снижение эффективности редактирования в сильно метилированных регионах. Доставка в ячейки также была сложной, поскольку TALEN намного больше, чем ZFN (~ 6 КБ против ~ 2 КБ), увеличивая количество времени и денег, необходимых для успешного редактирования. В то время как TALEN показали улучшение в технологии редактирования генома, высокая стоимость рабочей силы и денежные затраты все еще препятствовали ее широкому распространению.

Как и его предшественники ZFN, TALEN использовались в области медицины, а также сельского хозяйства. Ученые использовали TALEN для коррекции дисфункции COLA7A1 при эпидермолизной буллезе, заболевании, характеризующемся потерей целостности кожи, приводящей к потенциально смертельным волдырям кожи и повышенному риску возникновения рака кожи. В сельском хозяйстве ученые нашли способ создать устойчивый к болезнетворным микроорганизмам рис с использованием ТАЛЕНОВ.

4. Редактирование генов CRISPR-Cas9: революционное редактирование генома.
Ученые все еще искали более простой и быстрый способ редактирования генов. Перенесемся в 2012 год, когда все изменилось. Ученые обнаружили новый метод редактирования генома, основанный на CRISPR-Cas9, системе, которая долгое время существовала в бактериях, чтобы помочь им бороться с вторгающимися вирусами.

CRISPR представляет собой двухкомпонентную систему, состоящую из направляющей РНК и нуклеазы Cas9. Нуклеаза Cas9 разрезает ДНК в пределах ~ 20 нуклеотидных областей, определенных направляющей РНК. С CRISPR ученые могут настраивать свои направляющие РНК, и были разработаны алгоритмы для оценки вероятности нецелевых эффектов (то есть существует ли эта последовательность в других местах генома). Тем не менее, CRISPR-Cas9 гораздо более настраиваемый и экономически эффективный, что делает его более доступным для ученых, которые могут иметь бюджет и временные ограничения.